Kromatografi dan HPLC

BAB I
PENDAHULUAN
1. Kromatografi secara umum

Pemisahan campuran menjadi komponen-komponen adalah hal yang penting dalam semua cabang ilmu kimia dan tidak kalah penting dalam banyak bidang di teknik kimia dalam memecahkan berbagai masalah. Ketelitian kromatografi jarang sekali ditekankan. Dengan menggunakan metode kromatografi ,banyak kasus pemisahan bias diselesaikan dengan baik dan lebih efektif. Seperti :

• Menghitung polusi air dan udara
• Menentukan residu pestisida pada buah dan sayuran
• Mengidentifikasi dan mengklasifikasi senyawa organik
• Dll
Istilah kromatografi diturnkan dari kata-kata yunani yang berarti “warna” dan “tulis”. Kromatografi adalah suatu metoda yang digunakan untuk memisahkan suatu senyawa dalam suatu campurannya secara fisik dimana campuran tersebut dipisahkan berdasarkan distribusi senyawa-senyawanya diantara dua fasa,yaitu fasa diam (stasioner) dan fasa gerak (mobile). Fasa diam adalah fasa yang lebih besar jumlahnya pada kromatografi dan memiliki permukaan kontak yang lebih luas. Fasa diam (stasioner) dapat berupa :
• Cairan
• Padatan
• Padatan yang dibalut cairan (KLT)
Sedangkan fasa gerak adalah fasa yang mengalir bersama fasa diam. Fasa gerak bias berupa cairan ataupun gas. Dalam semua teknik kromatografi,zat-zat yang terlarut yang dipisahklan bermigrasi sepanjang kolom ataupun di dalam fasa diam dan tentui saja dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan sebuah zat yang terlarut sebagai hasil dua factor dimana yang satu cenderung menggerakkan zat terlarit itu dan yang satu cenderung untuk menahannya. Interaksi diatas menghasilkan keseimbangan ,dimana harganya dapat ditentukan dengan hokum distribusi yatu :

Cs = konsentrasi fasa diam
Cm = konsentrasi fasa gerak


Senyawa yang bergerak paling cepat akan juga cepat keluar sedangkan senyawa yang bergerak paling lama juga kan lama keluar. Cepat lamanya suatu senyawa melewati fasa diam dan fasa gerak terletak pada zat yang dikandung senyawa tersebut,dan dipengaruhi oleh :

• Susunan fasa diam
• Fasa gerak yang digunakan
• Suhu kolom

Pada kromatografi,secar umum proses yang terjadi adalah sebagai berikut:
Sampel dimasukkan ataupun dicampurkan biasanya dengan cara di-injeksikan,kemudian dimulailah penyebaran molekul yang disebabkan oleh difusi eddy. Difusi eddy adalah factor yang timbul akibat penggandaan lintasan untuk suatu aliran gas melalui suatu kolom yang berisi partikel-partikel dengan berbagai bentuk dan ukuran yang diatur secara tak beraturan. Ketika partikel tersebut mengalir melalui saluran-saluran di antara partikel-partikel packing. Besarnya kontribusi difusi eddy dari pelebaran pita mestinya bergantung pada ukuran partikel isian,bentuknya,dan keseragaman distribusi dalam kolom tersebut. Selain difusi eddy masih ada difusi longitudinal. Biasanya beberapa molekul zat terlarut cebderung berdifusi sepanjang gradient konsentrasi,sehingga suatu pita yang bergerak akan melebar dan akan meningkatkan panjang waktu yang dibutuhkan untuk mengelusi pita dari kolom. Lalu setelah itu senyawa bergerak keluar masuk dengan difusi dimana semua fasa gerak telah terjerembap kedalam fasa diam. Lalu molekul melakukan penetrasi ,lalu kembali ke fasa gerak lebih cepat dan mengikuti aliran untuk keluar dari kolom. Setelah keluar senyawa didieteksi oleh detector yaitu konsentrasinya yang dihubungklan bersama fungsi waktu. Dan ditunjukkan dengan kromatogram.

Kromatografi terdiri atas dua jenis jika dibedakan atas fasa yang digunakan:

• Kromatografi gas (GC)
• Kromatografi cair (LC)

Sedangkan pada kromatografi cair dibedakan kembali atas dua:

• Padat (LSC) dasar prosesnya adalah adsorpsi
• Cair (LLC) dasar prosesnya adalah partisi

2. Kromatografi kolom
Dasar proses ini disebut-sebut sebagai awal dari perkembangan teknik kromatografi tertua dan yang paling sederhana. Pada kromatografi kolom ini,sampel dimasukkan dalam corong sperti buret dan tentu saja dilewatkan dalam fasa gerak dan fasa cair yang berkesesuaian. Senyawa akan keluar dengan terpisah sesuai banyaknya zat yang terkandung dalam sampel tersebut.





Berikut gambar untuk memperjelas:




3. Kromatografi Lapis tipis (KLT) / Thin Layer Cromatograph


Kromatogarfi lapis tipis menggunakan prinsip dasar pada kromatografi dasar yaitu pemisahan campuran berdasarkan perbedaan distribusi senyawa pada dua fasa yang berbeda. Pada KLT fasa diamnya berupa silica yang terbalut oleh cairan. Sedangkan eluen digunakan pelarut baik yang polar maupun yang non-polar. Misalnya pada suatu kasus disediakan sampel ekstrak bunga (polar) dan digunakan dua pelarut yang berbeda yaitu: 1. etil asetat : aseton (7:3) ; 2. Etil asetat : heksana (8:2). Setelah pelarut dibuat,plat dimasukkan ke dalam gelas yang berisi pelarut tersebut dan ditutup agar pelarut bias diterima dengan baik. Kemudian setelah semua pelarut naik sampai tanda batas yang ditentukan,plat diambil dan diagin-anginkan. Bila perubahan warna yang terjadi tidak dapat dilihat oleh mata maka jalan lain yang harus diambil adalah meliohatnya dibawah sinar ultra violet, dan ditandai titik-titik noda yang terbuat pada plat dan lalu dibandingjkan dengan jarak keseluruhan plat guna mencari Retention Faktor ( Rf-nya ).



4. Elektroforesis

Kromatografi yang diberi media listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan posiif menuju kutub katopda dan anion ke anoda. Sehingga kecepatan bias diperkirakan dari banyaknya muatan yang terkandung.

5. Kromatografi penukar ion
Sesuai dengan namanya kromatografi ini khusus untuk masalah dengan kasus pertukaran ion sja.dengan meggunakan resin sintetik dan biasanya untuk mendeteksi dan pemisahan logam,seperti pada asam amino.

Contoh diatas merupakan kromatografi dasar yang ditemukan sebagai pendahuluan sebelum lahirnya peralatan-peralatan kromatografi yang lebih baik sepert GC dan HPLC. Untuk HPLC akan dibahas pada bab selanjutnya.































BAB II

MATERI

1. HPLC ( High Performance Liquid Cromatograph )

HPLC atau biasa disebut kromatografi cair kinerja tinggi adalah alat yang dikembangkan sesuai dengan kromatografi cair khususnya pada kromatografi kolom. Prinsip dari HPLC ini adalah dinamika dan migrasi dengan meggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap,dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan semakin baik.
Berikut skema HPLC:



Beberapa keunggulan HPLC dibanding alat lain:
• HPLC dilengkapi dengan adanya pompa. Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahansehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua system dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih berisifat akurat karena masing-masing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda.
• HPLC memiliki keunggulan kolom. Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC ≤ 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai.
• HPLC mempunyai detector yang amat sangat sensitive dan peka. HPLC memiliki beberapa detector misalnya:
 Detector ultraviolet
 Detector fluorometrik
 Detector elektrokimia

• Waktu retensi
Waktu yang dibutu8hkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detector disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya dipengaruhi oleh :
 Tekanan yang digunakan
 Kondisi dari fase diam
 Komposisi pelarut yang tepat
 Temperature kolom
`
• Kromatogram
Kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun pelarut yang kita gunakan belum pure,belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya.

Fasa gerak dalam HPLC memegang peranan penting karena sangat akan mempengaruhi kepada pemisahan,jadi ada beberapa criteria yang harus dipenuhi fasa gerak :

Murni,tidak ada pengotor
Sesuai dengan detector dan sampel
Tidak bereaksi dengan wadah
Harga murah dan mudah mendapatkannya
Dll.

Eluen akan membawa sampel sepanjang kolom dan tempat/wadah eluen tidak boleh bereaksi dengan pelarut dan harus disaring terlebih dahulu,hal ini dilakukan demi menjaga kebersihan pelarut maupun eluen dari pengotor-pengotor seperti debu dll. Selain itu eluenjuga haru bebas dari udara yang akan terbawa ke dalam pompa. Hal akan diakibatkan adalah tidak stabilnya tekanan yang dihasolkan nantinya.biasanya eluen yang dipakai adalah methanol ataupun etanol,semakin polar semakin baik.




BAB III

KESIMPULAN

1. Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling banyak digunakan

2. Prinsip pemisahan pada kromatografi adalah pemisahan berdasarkan perbedaan distribusi senyawa di campurannya pada dua fasa,fasa diam dan fasa gerak.

3. HPLC digunakan untuk analisis senyawa non-volatil termasuk sampel ionic dan polimerik

4. HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorpsi dan banyak digunakan dalam industry farmasi dan pestisida dll.

5. Senyawa yang paling lama muncul pada kromatogram adalah senyawa yang paling baik pemisahanya karena dia terjerembab lama didalam fasa diam.

6. Beberapa poin positive dari alat kinerja tinggi kromatografi (HPLC) adalah :

 Tingkat resolusi yang amat tinggi
 Waktu yang digunakan sedikit
 Detector amat peka
 Kolom dapat digunakan kembali dengan cara diregenerasi
 Ideal untuk zat berberat molekul tinggi dan memiliki titik didih tinggi.

7. Beberapa sampel yang dapat dianalisis dengan HPLC :

 Asam amino
 Asam organic
 Hidrokarbon aromatic
 Protein
 Karbohidrat
 Vitamin
 Seyawa lain berberat molekul tinggi dan titik didih tinggi.







DAFTAR PUSTAKA






1. Gritter Roy.dkk.1991.pengantar kromatografiedisi kedua.penerbit itb bandung

2. R.A.Day n A.L.Underwood.2002.analisa kikia kuantitatif edisi 6.jakarta.erlangga

3. www.wikipedia/kromatografi.org

4. www.chem-is-try.org/kromatografikolom

5. Yoshiti takeuchi.blogspot.com/kromatografi.net/2009

6. www.indigo.com/ science-supplies/filterpaper. Html

7. www.um-community.blogspot.com/kromatografi

8. www.allaboutscience.blogspot.com/kromatografikertas-TLC/kegunaanHPLC